توضیحات کادر اول- فرایند بالادستی ((Upstream

• داروهای بیولوژیک

داروهای بیولوژیک عمدتاً پروتئین‌های نوترکیب درمانی هستند که توسط فرآیندهای بیولوژیک و یا بیوتکنولوژیکی با استفاده از چندین سیستم بیان مختلف از جمله خطوط سلولی پستانداران، میکروارگانیسم‌ها، حشرات و گیاهان تولید می‌شوند.

• سلول‌ها و میکروارگانیسم‌های تولید کننده داروهای بیولوژیک
  • باکتری‌ها

استفاده از داروهای بیولوژیک پروتئینی در سلامت انسان به قرن نوزدهم بر می‌گردد که برای اولین بار از آنتی توکسین دیفتری جدا شده از سرم حیواناتی مانند اسب یا گوسفند ایمن شده استفاده گردید و پس از آن در قرن بیستم از مولکول‌هایی مانند انسولین، هورمون رشد و … که همه از منابع حیوانی به دست می‌آمدند، استفاده گردید.

با توجه خطرات مرتبط با پروتئین‌های حیوانی غیر انسانی، صنعت تولید داروهای بیولوژیک آغاز به تولید داروهای بیولوژیک با استفاده از تکنیک‌های DNA نوترکیب در میکروارگانیسم‌ها نمود. نمونه کلاسیک این رویکرد، تولید انسولین (برای درمان دیابت نوع I و II) در Escherichia coli است. در ابتدا، انسولین از عصاره پانکراس گاو و خوک خالص سازی می‌شد که علاوه بر گران بودن، سبب بروز پاسخ‌های ایمنی ناشی از انسولین حیوانی در بیماران می‌شد، اما در تکنیک استفاده ازِ DNA نوترکیب، ژن انسانی هدف از میزبان جدا شده و به یک ناقل (پلاسمید) متصل می‌شود و از این پلاسمید حاوی ژن انسانی برای تبدیل سلول‌های باکتریایی که قادر به تولید مقادیر بالایی از پروتئین نوترکیب هدف هستند، استفاده می‌شود.

• قارچ‌های رشته‌ای

تنوع زیاد مولکول‌های تولید شده توسط قارچ‌های رشته‌ای، استفاده از این موجودات برای تولید داروهای بیولوژیک را توجیه می‌کند. به طور مثال از برخی قارچ‌های اندوفیت، تاکسول (ماده طبیعی ضد سرطان) جداسازی می‌گردد و یا از آنزیم‌های خارج سلولی تولید شده توسط قارچ‌های رشته‌ای β-d-گالاکتوزیداز (لاکتاز – EC. 3.2.1 23) (این آنزیم مسئول کاتالیز لاکتوز به گلوکز و گالاکتوز است و در درمان عدم تحمل لاکتوز استفاده می‌شود) تولید می‌گردد.

یکی دیگر از داروهای بیولوژیکی که از قارچ‌ها به دست می‌آید، آنزیم آسپاراژیناز است. این آنزیم برای درمان انواع بیماری‌ها مانند لوسمی لنفوبلاستیک حاد و لنفوم غیر هوچکین استفاده می‌شود. از آنجایی که سلول‌های تومور برای تکثیر خود به منبع خارجی آسپاراژین وابسته هستند، وجود دارویی که آسپاراژین را از جریان خون تخلیه می‌کند، باعث مرگ سلول‌های سرطانی می‌شود.

با وجود اثربخشی داروهای بیولوژیک تولید شده توسط قارچ‌های رشته‌ای، کاربرد مولکول‌های زیستی تولید شده توسط چنین موجوداتی هنوز به دلیل هزینه بالای خالص سازی برخی مولکول‌ها و مشکل در کشت قارچ رشته‌ای محدود شده است در جدول زیر برخی از داروهای بیولوژیکی تولید شده توسط قارچ‌ها آمده است.

• مخمرها

مخمرها به عنوان میزبان تولید ترکیبات نوترکیب، برای سنتز انواع زیادی از ترکیبات، مانند آروماتیک‌ها، ترپنوئیدها، استرول‌ها، الکل‌ها، مشتقات قند، اسید سیتریک، اسید لاکتیک، اسیدهای آلی و چرب، ترپن ها، پپتیدها و چندین مورد پروتئین‌های درمانی مهم پزشکی استفاده می‌شوند.

بیش از 40 پروتئین نوترکیب مختلف توسط Saccharomyces cerevisiae تولید شده است که شامل چندین داروی زیستی است که در جدول زیر آمده است.

داروهای بیولوژیک تولید شده توسط Saccharomyces cerevisiae عبارتند از انسولین و آنالوگ‌های انسولین، آلبومین سرم انسانی، واکسن‌های هپاتیت و ذرات شبیه ویروس، به عنوان مثال برای واکسیناسیون علیه ویروس پاپیلومای انسانی.

استفاده از مخمر Saccharomyces cerevisiae برای تولید داروهای بیولوژیک مزایای زیر را به همراه دارد:

• تاخوردگی مناسب بسیاری از پروتئین‌های انسانی تولید شده
• ترشح خارج سلولی پروتئین‌های تولید شده و ایجاد سهولت در فرایند خالص سازی
• انجام بسیاری از اصلاحات پس از ترجمه از جمله تشکیل پیوند دی سولفیدی، سیالیلاسیون و گلیکوزیلاسیون.

با وجود مزایای فراوان استفاده از مخمرها محدودیت‌هایی نیز در این مورد وجود دارد مانند عدم توانایی مخمر در انجام N-گلیکوزیلاسیون با مانوز بالا که نیمه عمر و اثربخشی پروتئین را کاهش می‌دهد.

• سلول‌های پستانداران

استفاده از سلول‌های پستانداران در تولید داروهای بیولوژیک از ابتدا با مشکلات زیر همراه بوده است:

• سخت‌تر بودن تولید سلول نوترکیب پستاندار نسبت به میکروارگانیسم‌ها
• سخت‌تر بودن افزایش حجم کشت سلول پستانداران نسبت به میکروارگانیسم‌ها
• بازده کم سلول پستانداران نسبت به میکروارگانیسم‌ها
• پیچیدگی محیط کشت سلول مورد نیاز برای رشد سلول‌های پستانداران
• نیاز سلول پستانداران به سرم برای رشد
• حساسیت سلول پستانداران به تنش‌های محیطی
• رشد کندتر سلول‌های پستانداران نسبت به سایر میکروارگانیسم‌ها

با وجود مشکلات ذکر شده در استفاده از سلول‌های پستانداران برای تولید داروهای بیولوژیک، با توجه به اینکه سلول‌های پستانداران توانایی ایجاد تغییرات پس از ترجمه از طریق گلیکوزیلاسیون را دارند، می‌توان از طریق این سلول‌ها آنتی بادی‌های پیچیده درمانی را تولید کرد. بعلاوه پس از چند دهه کارفشرده در بهینه‌سازی شرایط رده های سلولی، محیط کشت و بیوراکتور، در حال حاضر بیان پروتئین بیشتر از 10 g/L و تراکم سلولی بیش از 20 X10⁶ cells /ml برای سلول‌های پستانداران قابل دستیابی است.

• سلول‌های حشره‌ای

سهم نسبتاً کمی (فقط 2-3 ٪) از تمام ترکیبات دارویی فعال تازه تأیید شده، با سلول‌های حشرات به عنوان میزبان تولید می‌شوند. با استفاده از سلول‌های حشرات می‌توان پروتئین‌های نوترکیب و ذرات ویروس‌مانند (VLPs) تولید کرد. سیستم انتخابی برای پرورش سلول‌های حشرات به صورت سوسپانسیون است و نباید از تفاوت‌های قابل توجه در نیاز اکسیژن بین این سلولها و سایر سلول‌ها غافل شد، به طور مثال سلول‌های Spodoptera frugiperda (Sf9) چهار و Trichupulsia Ni (Hi5)، 13 برابر نرخ مصرف اکسیژن ویژه بالاتر از سلول‌های CHO را نشان می‌دهند.

سلول‌های حشره‌ای بیشتر با سیستم ناقل بیان باکولوویروس (BEVS) مورد استفاده قرار می‌گیرند و به‌ سرعت به عنوان پلتفرمی برای تولید پروتئین نوترکیب در حال رشد هستند. سلول‌های حشره ای چندین مزیت نسبی را نسبت به سلول‌های پستانداران دارند، مانند سهولت کشت، تحمل بالاتر به اسمولالیته، By product های کمتر و سطوح بیان بالاتر، اما با توجه به اینکه پروتئین تولید شده توسط سلول‌های حشره‌ای N-گلیکان‌های کوتاه‌تر و سیالیلاسیون کمتری دارند، در همه موارد قابل استفاده نیستند.

• فرایند تولید داروهای بیولوژیک

فناوری تولید داروهای بیولوژیک را می‌توان به فرآیندهای بالادستی (Upstream) و پایین دستی (Downstream) تقسیم کرد.

2-1- فرایند تولید بالادستی(Upstream)

فرآیند تولید بالادستی مرحله رشد سلول یا میکروارگانیسم مورد نیاز برای تولید داروهای بیولوژیک یا سایر مولکول‌های زیستی است و شامل مواردی از جمله انتخاب رده سلولی، انتخاب محیط کشت، تنظیم پارامترهای رشد و بهینه‌سازی فرآیند تولید برای دستیابی به شرایط بهینه رشد سلولی و تولید داروی بیولوژیک است. هدف اصلی فرآیند بالادستی، تبدیل محیط کشت به محصولات متابولیکی مورد نظر است و این امر مستلزم شرایط کاملاً کنترل شده (دما، pH، درصد اکسیژن محلول، میزان همخوردگی محیط کشت و..) و استفاده از تجهیزات مناسب کشت (بیوراکتورها، فرمانتورها، رولرها و..) در مقیاس بزرگ است. فرایند بالادستی تولید داروهای بیولوژیک و بیوتکنولوژیک به 2 صورت کلی انجام می‌شود:

2-1-1- کشت سلولی چسبنده

کشت سلولی چسبنده نوعی از کشت سلولی است که در آن سلول‌ها برای رشد نیاز به اتصال به یک سطح تک لایه دو بعدی دارند که چسبندگی و گسترش سلول را تسهیل کند. اکثر سلول‌های مشتق شده از مهره‌داران (به استثنای سلول‌های خونساز) را می‌توان به این روش کشت داد. در این نوع کشت از تجهیزات زیر برای کشت سلولی و افزایش حجم کشت استفاده می‌شود:

Petri dish and T-Flask2-1-1-1-

به طور معمول، سلول‌های چسبنده به صورت تک لایه در ظروف کشت مانند پتری دیش‌ها و T-Flask ها رشد می‌کنند. T-Flask ها از نظر اندازه متفاوت هستند و می‌توانند سطحی از 25 cm² تا 225 cm² را برای کشت سلولی فراهم کنند. از این ظروف کشت برای تولید بذر سلولی مقیاس کوچک نیز استفاده می‌شود.

Multi-tray systems2-1-1-2-

Multi-Tray systems در سیستم‌های کشت سلولی که به مساحت سطحی تا 25400 cm² مربع نیاز باشد، کاربرد دارند. در این حالت با سینی‌هایی که روی هم چیده شده‌اند، یک سطح چند سطحی بزرگ برای چسبندگی و رشد سلول فراهم می‌شود. با وجود مزیت‌هایی که این سیستم نسبت به T-Flask دارد در اصل این سیستم هنوز یک T-Flask بزرگ با چندین لایه است. از این رو، Multi-Tray systems نیز یک سیستم استاتیک سنتی بدون هم زدن، هوادهی یا حرکت محیط کشت باقی می‌ماند. در این سیستم کشت نگرانی‌هایی در رابطه با تفاوت‌های احتمالی در تبادل گازی بین واحد میانی و واحدهای بالا یا پایین این سیستم وجود دارد که می‌تواند منجر به تغییر در عملکرد و کیفیت سلول‌ها شود.

Roller bottles2-1-1-3-

رولر باتل ها به طور گسترده‌ای برای کاربردهای بیوتکنولوژی، به ویژه در توسعه واکسن‌ها استفاده می شود. برخلاف سیستم‌های استاتیک، رولر باتل ها امکان هم زدن محیط کشت (از طریق غلتک‌هایی که روی آن قرار گرفته‌اند) را فراهم می‌کنند و می‌توانند سطح بزرگتری نسبت به T-Flask های استاندارد ایجاد کنند.

2-1-2-کشت سلولی معلق (بیوراکتور یا فرمانتور)

فرآیند کشت سلولی معلق در مقیاس بزرگ شامل چند مرحله است که عبارتند از seed train(که داخل Shake flask یا Spinner flask انجام می‌شود) Inoculum train(که در بیوراکتورها انجام می‌شود) و مرحله تولید. موفقیت در افزایش مقیاس فرآیند معمولاً با شاخص‌های کلیدی فرآیند (تراکم سلولی، زنده‌مانی، مقدار بیان پروتئین) و ویژگی‌های کیفی محصول سنجیده می‌شود.

Spinner Flask

Shake Flask

Scale up کشت سلولی به بیوراکتورهای مقیاس بزرگ در برخی موارد از نظر تأمین اکسیژن کافی و حذف CO2 تولید شده توسط

سلول، می‌تواند چالش برانگیز باشد و این موارد به مقدار زیادی به پارامترهای عملکردی تنظیم شده برای بیوراکتور نهایی بستگی دارد. این پارامترها عبارتند از:

• حجم سوپ سلولی در بیوراکتور
• حجم فید و مقدار فید دهی
• میزان هم خوردگی بیوراکتور
• میزان هوادهی و میزان اکسیژن محلول
• pH
• دما

علاوه بر چالش‌های عملیاتی بیوراکتور در مقیاس بزرگ، مشکلالت دیگری نیز وجود دارد که عبارتند از:

• تغییر بچ به بچ مواد اولیه تولید
• یکنواختی ساخت محیط کشت در حجم‌های مختلف
• پایداری Stability سلول
• آلودگی بیوراکتور توسط سایر میکروارگانیسم‌ها
• اشتباهات منابع انسانی