فرایند تولید پایین دستی(Downstream)

فرایند تولید پایین دستی (DSP) مجموعه ای از عملیات مورد نیاز برای خالص سازی مواد بیولوژیکی از سوپ کشت سلولی و یا بافت است.اکثر داروهای بیولوژیک از استراتژی خالص سازی سه مرحله‌ای استفاده می‌کنند:

• Capture
• Intermediate Purification
• Polishing

هر مرحله خالص سازی منجر به خلوص بالاتر محصول می‌شود. با این حال، با هر مرحله خالص سازی، ریکاوری کلی فرایند خالص سازی کاهش می‌یابد بنابراین باید هم زمان خالص شازی کوتاه‌تر باشد (برای حفظ فعالیت و ثبات پروتئین) و هم تعداد مراحل خالص سازی در حداقل خود باشد که هزینه‌های خالص سازی پروتئین کاهش یابد. با این وجود، تمام ناخالصی‌ها باید حذف شوند تا از پاسخ ایمنی در بیمار جلوگیری شود. مراحل اصلی مورد نیاز برای دستیابی به محصول نهایی خالص به شرح زیر است:

1-(Clarification)Capture

پس از هاروست، خالص سازی چند مرحله‌ای شروع می‌شود که Primary recovery اولین مرحله از آن است که پس از هاروست برای جداسازی پروتئین هدف از محیط کشت، سلول‌ها و بقایای سلولی به کار می‌رود.

پروتئین‌های هدف می‌توانند به صورت درون سلولی یا خارج سلولی تولید شوند که بر مراحل بعدی خالص سازی تأثیر می‌گذارد. در مورد کشت سلولی پستانداران، بیشتر پروتئین به صورت خارج سلولی تولید می‌شود و این بدان معنی است که فقط سوپ رویی باید برای خالص سازی جمع آوری شود. پس از جمع آوری مایع رویی ممکن است از سانتریفیوژ یا Depth filtration و یا ترکیبی از هردو برای Clarification سوپ سلولی استفاده شود و به دنبال آن از میکروفیلتراسیون استفاده می‌شود تا سوپ سلولی جمع آوری شده به صورت استریل وارد مراحل بعدی خالص سازی گردد.

Disk Stack Centrifuge

Depth filtration

در تولید داروهای بیولوژیک با استفاده از میکروارگانیسم‌ها، پروتئین هدف می‌تواند در داخل سلول‌ها تجمع یابد، بنابراین سلول‌ها باید تخریب شوند و بقایای سلولی از پروتئین مورد نظر جدا شوند. یکی از متداول‌ترین روش‌های تخریب سلولی، استفاده از هموژنایزرهای با فشار بالا است که در این روش تمام محتویات سلول از جمله پروتئازها آزاد می‌شود، بنابراین در این روش برای جلوگیری از تخریب محصول، ممکن است لازم باشد مهارکننده‌های پروتئاز مانند PMSF، EDTA و Pefabloc به سوپ هموژن شده اضافه شوند. با این حال، این ترکیبات باید در طول مراحل خالص سازی حذف شوند.

پس از Capturing یک سری مراحل کروماتوگرافی برای خالص سازی بیشتر پروتئین هدف انجام می‌شود و پروتئین‌ها بر اساس بار، اندازه یا آبگریزی پروتئین یا براساس میل ترکیبی خاص به رزین کروماتوگرافی از سوپ سلولی جدا می‌شوند.

اولین مرحله پس از Clarification، جذب کروماتوگرافی (Affinity Chromatography) است که محصول را از ناخالصی‌های عمده‌ای مانند اجزای محیط کشت سلولی جدا می‌کند.

کارآمدترین راه برای کاهش ناخالصی‌ها این است که در صورت امکان، خالص سازی با یک مرحله کروماتوگرافی میل ترکیبی (Affinity chromatography) انجام شود. به عنواتن مثال در تولید آنتی بادی مونوکلونال، کروماتوگرافی میل ترکیبی پروتئین A به طور گسترده برای مرحله جذب استفاده می‌شود و ممکن است خلوص بالای 95% پس از اولین مرحله به دست آید، به این معنی که قبل از مراحل فرمولاسیون نهایی فقط Polishing محدود مورد نیاز است. با این حال، اکثر فرآیندهای مربوط به محصولات مرتبط با آنتی بادی (mAbs، آنتی‌بادی‌های دوگانه، قطعات Fab) و سایر پروتئین‌های نوترکیب به حداقل دو مرحله Polishing پس از کروماتوگرافی میل ترکیبی نیاز دارند.

2- Intermediate Purification

اگر هیچ رزین کروماتوگرافی میل ترکیبی برای مولکول هدف در دسترس نباشد، مرحله دوم خالص سازی باید برای حذف بخش عمده‌ای از ناخالصی‌های مربوط به فرآیند و محصول مانند ناخالصی‌های با وزن مولکولی بالا (High Molecular Weight)، پروتئین‌های سلول میزبان (Host Cell Proteins) و DNA سلول میزبان طراحی شود. اگر مرحله گرفتن پروتئین (Protein capturing) بر اساس کروماتوگرافی میل ترکیبی نباشد، مرحله بین گرفتن پروتئین و مرحله پرداخت نهایی را می‌توان «خالص سازی میانی» نیز نامید (مانند شکل زیر).

3- Polishing

تکنیک‌هایی که معمولاً در این مرحله استفاده می‌شوند عبارتند از:

Ion Exchange Chromatography (IEX)3-1-

ترجیحاً از IEX به عنوان اولین مرحله Polishing استفاده می‌شود چرا که به بهینه سازی کمتری نیاز دارد. همچنین به دلیل سادگی برهمکنش‌های الکترواستاتیکی این روش قابل پیش بینی تر نسبت به تکنیک‌هایHydrophobic interaction chromatography و Multimodal (or mixed mode) chromatography است.

کروماتوگرافی تبادل کاتیونی (CIEX) معمولاً در حالت اتصال و شستشو (bind-and-elute) برای مولکول هدف استفاده می‌شود، که ناخالصی‌های دارای بار منفی مانند HCP(Host Cell Protein) های باقیمانده را در طول بارگذاری نمونه یا در بخش شستشو حذف می‌کند. CIEX همچنین قدرت جداسازی انواع شارژ واریانت آنتی‌بادی، پروتئین A و مولکول‌های با وزن بالا مانند فرم‌های اگریگه را در طول مرحله شستشو دارد.

پردازش (Polishing) مب ها را می‌توان با استفاده از کروماتوگرافی تبادل آنیونی (AIEX) در حالت جریان عبوری (Flow through Mode) نیز انجام داد که در این حالت ویروس‌ها، DNA و HCP های اسیدی به لیگاند رزین متصل می‌شوند در حالی که مولکول هدف در جریان کروماتوگرافی شسته شده و جمع آوری می‌شود.

Hydrophobic interaction chromatography (HIC)3-2-

برای خالص سازی آنتی بادی‌های مونوکلونال، از تکنیک HIC اغلب در حالت FT(Flow through) استفاده می‌شود. این حالت برای حذف مولکول‌های بزرگ مانند فرم‌های اگریگه به خوبی عمل می‌کند.

Multimodal (or mixed mode) chromatography (MMC)3-3-

از تکنیک MMC زمانی استفاده می‌شود که رزین‌های تک عاملی نتوانسته باشند کارایی مورد انتظار در خالص سازی پروتئین‌ها را داشته باشند. رزین‌های چند وجهی دو نوع عمده دارند: MM AIEX و MM CIEX. که هر دوی آنها این مزیت را دارند که می‌توانند در کانداکتیویتی های بالاتراز یک مبدل یونی معمولی، به مولکول هدف متصل شوند. علاوه بر این، رزین‌های MM AIEX گاهی اوقات زیر نقطه ایزوالکتریک (pI) پروتئین نیز به آن متصل می‌شوند. بنابراین، رزین‌های MM در موارد زیر استفاده می‌شوند:

• کانداکتیویتی بارگذاری نمونه برای یک رزین سنتی تبادل یونی بسیار زیاد باشد
• زمانی که تعداد مراحل خالص سازی باید حداقل باشد
• انتخاب پذیری متفاوت از آنچه که توسط انواع برهمکنش یونی یا آبگریز منفرد به تنهایی ارائه می‌شود مورد نیاز است.

در شکل زیر ساختار یک رزین Multimodal آورده شده است. این رزین یک مبدل کاتیونی Mixed Mode با خواص یک مبدل کاتیونی ضعیف است. لیگاند جفت شده به سطح رزین امکان برهمکنش‌های الکترواستاتیکی و همچنین برهمکنش آبگریز، پیوند هیدروژنی یا برهمکنش تیوفیلی را فراهم می‌کند که باعث می‌شود نمونه بدون رقت یا مرحله تبادل بافر بارگذاری شود و در نتیجه بهره وری فرایند افزایش یابد.

3-4- Size exclusion chromatography

کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) مولکول‌ها را بر اساس اندازه آنها با فیلتر کردن از طریق ژل جدا می‌کند. ژل از دانه‌های کروی حاوی منافذ با توزیع اندازه خاص تشکیل شده است و مولکول‌ها بسته به اندازه یا داخل این ماتریکس گیر می‌کنند و یا از آن خارج می‌شوند. در این روش هیچ برهمکنشی بین ستون و مولکول‌های پروتئین صورت نمی‌گیرد، بنابراین می‌توان از بافرهایی با ویژگی‌های فرمولاسیون نهایی نیز در آن استفاده کرد.

در نهایت پس از تمام مراحل کروماتوگرافی، یک مرحله فیلتراسیون دیگر انجام می‌شود تا اطمینان حاصل شود که تمام ناخالصی‌ها از جمله پاتوژن‌های باکتریایی از محصول نهایی حذف شده است.